Cellesignalering etter PDT : betydning av nekrose, apoptose og autofagi

Author(s)

Publication date

2009-05

Publisher

Høgskolen i Oslo. Avdeling for helsefag

Document type

Description

Master i biomedisin

Abstract

Bakgrunn: Begrensningene med mange av dagens kreftbehandling er mangel på selektivitet (Abraham and Altaha 2007). Fotodynamisk terapi (PDT) er en relativ ny behandlingsalternativ innen kreftbehandling (Ortel et al. 2009). Lysaktiverbare forbindelser (fotosensitizere), synlig lys og oksygen er de viktigste komponentene i PDT. PDT medierer dannelse av reaktiv oksygen forbindelser (ROS) som induserer celledød ved nekrose, apoptose og autofagi avhengig av flere faktorer blant dem lokaliseringen av fotosensitizeren intracellulært. Lite skade oppstår på normalt vev grunnet høy akkumulering av fotosensitizer i tumor etterfulgt av begrensende lyseksponering til behandlingsområde. En annen ny metode under utvikling er fotokjemisk internalisering (PCI) (Selbo et al. 2002). Metoden benyttes til å levere makromolekyler som proteiner, DNA og RNA. Makromolekylet lokaliseres i endosomer/lysosomer med fotosensitizerene bundet til membranen. Belysning av fotosensitizeren danner ROS som resulterer i ruptur på endosomale/lysosomale membraner. Som et resultat av dette blir makromolekylet frigjort til cytosol hvor den kan uttøve ønsket effekt. Hensikt: I denne oppgaven var hovedmålet å studere mekanismer som er involvert i PDT indusert celledød med særlig hensyn til nekrose, apoptose og autofagi. Kunnskapen kan brukes til blant annet å optimalisere PCI med spesielt hensyn til hvilke type makromolekyl som skal gis. Metode: Metodene som ble benyttet er PDT/PCI behandling av ZR-75-1, med fotosensitizeren TPCS2a samt fluorescensmikroskopi, fluorescensmålinger, SDS-PAGE, Western blot og MTT-assay til måling av celleviabilitet. Resultater: PDT og PCI induserte cytotoksiske effekter i ZR-75-1 cellene målt som redusert viabilitet. PCI av saporin var mer effektiv enn PDT da den ga celledød ved lavere lysdoser i forhold til PDT. Nekrose ble indusert i liten grad etter TPCS2a-PDT. Apoptoseassosiert caspase-3 aktivitet, PARP kløving og kjernekondensering ble observert etter PDT. I tillegg ble autofagiassosiert LC3B-II transformasjon observert. Både apoptose og autofagi ble indusert avhengig av lysdoser og tiden etter PDT. Konklusjon: TPCS2a-PDT induserer i liten grad nekrose i ZR-75-1 cellene. Både apoptose og autofagi blir derimot indusert etter PDT i ZR-75-1 cellene. Immunorespons forårsaket av nekrose kan forventes å være av mindre betydning etter TPCS2a-PDT.
Background: One of the problems in cancer therapy today is lack of selectivity (Abraham and Altaha 2007). Photodynamic therapy (PDT) is a relatively new alternative in cancer therapy (Ortel et al. 2009). The process of cell destruction is induced by a light activated compound (fotosensitizer) and oxygen after visible light exposure. The light exposure induces formation of reactive oxygen species (ROS). PDT treated cells has been shown to induce necrosis, apoptosis and autophagy. Normal cells are damaged in to a lesser degree due to the photosensitizers high accumulation in tumor and limitation of the treated area by exposing only the tumor area to light. Another novel cancer treatment under development is photochemical internalization (PCI) (Selbo et al. 2002). The principle of this method is to enhance the delivery of macromolecules such as proteins, DNA and RNA to the cells. The macromolecules are located in the membranes of endosomes/lysosomes. The ROS mediate rupture of these membranes after light exposure and the macromolecules are released into the cytosol where they have access to their targets. Purpose: In this thesis the mechanisms involved in PDT induced cell death was investigated, mainly necrosis, apoptosis and autophagy. This knowledge is used to optimize PCI by using the type of macromolecule that can optimize the therapeutic outcome. Method: PDT and PCI treatment of ZR-75-1 cells with TPCS2a as the photosensitizer was the primary method utilized in this study. The MTT-assay was used to investigate the cell viability after these treatments. To investigate the mechanism of PDT induced cell death spectrofluorometry, fluorescence microscopy, SDS-PAGE and Western blot were used. Results: A decrease in cell viability after PDT and PCI was observed. PCI showed a greater effect at a lower light dose compared with PDT. Necrosis was induced in a less degree after TPCS2a-PDT in ZR-75-1 cells. Apoptosis associated caspase-3 activity, PARP cleavage and nuclear condensation was observed after PDT. In addition autophagy associated LC3B-II formation was observed. Both apoptosis and authophagy was induced in a light dose-dependent manner as well for the time after PDT. Conclusion: TPCS2a-PDT induced necrosis to a low extent in the ZR-75-1 cells. Both apoptosis and autophagy where on the other hand induced after PDT. The immunoresponse associated with necrosis may be absent after PDT.

Keywords

Permanent URL (for citation purposes)

  • http://hdl.handle.net/10642/219